ELISA試劑盒優(yōu)異的試劑，杰出的儀器和準(zhǔn)確的操作是確保ELISA查看成果準(zhǔn)確牢靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的構(gòu)成不一樣而有所區(qū)別，國內(nèi)醫(yī)學(xué)查驗通常均用板式。本文將敘說板式ELISA各個操作進(jìn)程的留意關(guān)鍵（珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特別儀器合作運(yùn)用，兩者均有詳細(xì)的運(yùn)用闡明，須嚴(yán)厲遵循規(guī)程操作）。
標(biāo)本的采納和保留
通常咱們可用于ELISA查看的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培育上清或安排勻漿液等，不一樣類型的查看樣本前期的處理辦法是不一樣的。準(zhǔn)確的處理樣本是確保ELISA查看的準(zhǔn)確性和準(zhǔn)確性的*步，下面簡略介紹一下不一樣類型的樣本的處理辦法。
血清
血清是zui常用于ELISA查看的一類樣本，處理也比較簡略。
用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管搜集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃，使血清分出。（將試管或離心管歪斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的分出。）4℃1000×g離心20min，細(xì)心搜集上清。主張將血清分裝多份，-20℃或-80℃保留，防止重復(fù)凍融。采血進(jìn)程中應(yīng)防止溶血，由于紅細(xì)胞裂解時會開釋具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為符號的ELISA查看中會有非特異性的顯色，而致使查看的不準(zhǔn)確性。一起也應(yīng)防止細(xì)菌污染，由于菌體內(nèi)也許富含內(nèi)源性的HRP然后致使查看的假陽性。
血漿
ELISA試劑盒用含抗凝劑的采血管或離心管搜集血液標(biāo)本，標(biāo)本搜集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保留，防止重復(fù)凍融。防止運(yùn)用溶血或高血脂的標(biāo)本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，查看時還應(yīng)細(xì)心閱覽試劑盒闡明書，查看試劑盒是不是對抗凝劑有特別請求。
細(xì)胞培育上清
取細(xì)胞培育上清到離心管，1000×g離心20min，除掉細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重復(fù)凍融。 
細(xì)胞裂解液
1) 吸去培育板內(nèi)的培育基，用胰酶消化細(xì)胞，加恰當(dāng)培育基將細(xì)胞從培育板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。
2) 搜集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培育基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。
3) 參加恰當(dāng)?shù)念A(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前參加蛋白酶按捺劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需求150~250μL PBS重懸。
4) 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫凍結(jié)樣品，重復(fù)凍融幾回，使細(xì)胞充沛裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以到達(dá)裂解的意圖。
5) 4℃10000×g 離心10min，除掉細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重復(fù)凍融。
安排勻漿液
1) 將安排樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖刷，洗去安排外表殘留的血液或雜質(zhì)。
2) 將安排塊稱重，記載后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充沛。
3) 將安排按必定的份額參加預(yù)冷的PBS（臨用前參加蛋白酶按捺劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按安排分量：PBS體積=1:9的份額勻漿，例如1g的安排樣本對應(yīng)9mL的PBS，詳細(xì)體積可依據(jù)試驗需求恰當(dāng)調(diào)整，查看后核算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）。
4) 汲取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重復(fù)凍融。尿液、唾液等別的液體生物樣本
1000×g離心20min，取上清即可查看。
總的來說，由于ELISA只能查看可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)確保一切樣本均為弄清的液體，沉積或懸浮物都應(yīng)離心去掉。
為了確保查看的準(zhǔn)確性，保留于-20℃或-80℃的樣本在1~6個月內(nèi)查看；4℃保留的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行查看。
別的，還應(yīng)確保樣本不含NaN3，由于NaN3會按捺HRP的活性，然后致使假陰性的成果。
試劑的預(yù)備
按試劑盒闡明書的請求預(yù)備試驗中需用的試劑。ELISA頂用的蒸餾水或去離子水，包含用于洗刷的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗刷液運(yùn)用pH計丈量。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后運(yùn)用，通常室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗不需用的有些應(yīng)及時放回冰箱保留
加樣
在ELISA中通常有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行發(fā)作氣泡。
加標(biāo)本通常用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，防止發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（通常不主張運(yùn)用）。有些目標(biāo)查看（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震動器上震動1min。加酶物工作液和底物工作液時可用多道移液器，使加液進(jìn)程在zui短時刻內(nèi)完結(jié)。
保溫
在ELISA中通常有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶物后?？乖贵w反響的完結(jié)需求有必定的溫度和時刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的只在固相外表上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有均等的和固相抗的時機(jī)，只要zui靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個逐步平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才干到達(dá)反響的結(jié)尾。在這以后參加的酶符號抗體與固相抗原的也一樣如此。這即是為何ELISA反響總是需求必定時刻的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體的適宜溫度。在建立ELISA辦法作反響動力學(xué)研討時，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)品的生成可達(dá)高峰。為加快反響，可進(jìn)步反響的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以構(gòu)成zui多的沉積。但因所需時刻太長，在ELISA中通常不予選用。 
保溫的辦法除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，通常均選用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度敏捷平衡。為防止蒸騰，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此刻可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性杰出的資料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，終究將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)則的溫度，特別是在氣溫較低的時分更應(yīng)如此。為防止酶標(biāo)板底部受水汽或磨損致使的讀數(shù)差錯，通常選用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個進(jìn)程有必要在酶標(biāo)板上方貼封紙，防止蒸騰。無論是水浴仍是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)厲約束在規(guī)則的規(guī)模內(nèi)，規(guī)范室溫溫度是指20-25℃，但詳細(xì)操作時可依據(jù)闡明書的請求操控溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)留意溫育的溫度和時刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。為確保時刻準(zhǔn)確，一個人一次不宜多于兩塊板一起操作、測定。
洗刷
洗刷在ELISA進(jìn)程中雖不是一個反響進(jìn)程，但卻也決議著試驗的成敗。ELSIA即是靠洗刷來到達(dá)別離游離的和的酶符號物的意圖。經(jīng)過洗刷以鏟除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體的物質(zhì)，以及在反響進(jìn)程中非特異性地吸附于固相載體的攪擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗刷時又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。能夠說在ELISA操作中，洗刷是zui首要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)厲按請求洗刷，不得大意。
洗刷的辦法除某些ELISA儀器配有特別的主動洗刷儀外，手工操作有浸泡式和流水沖刷式兩種，進(jìn)程如下：
（1）浸泡式：a.吸干或甩干孔內(nèi)反響液；b.用洗刷液過洗一遍（將洗刷液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，行將洗刷液注滿板孔，放置1-2min，間歇搖擺，浸泡時刻不行隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗刷3-4次（按闡明規(guī)則）。在間接法中如本底較高，可增加洗刷次數(shù)或延伸浸泡時刻。
微量滴定板多選用浸泡式洗刷法。洗刷液多為含非離子型洗刷劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的是疏水性的，非離子型洗刷劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵，然后削弱蛋白質(zhì)與固相載體的，并借助于親水基團(tuán)和水分子的效果，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液情況，然后脫離固相載體。洗刷液中的非離子型洗刷劑通常是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖刷式：流水沖刷法開始用于小珠載體的洗刷，洗刷液僅為蒸餾水乃至可用自來水。洗刷時附接一特別設(shè)備，使小珠在流水沖擊下不斷地翻滾淋洗，持續(xù)沖刷2min后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2min，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖刷式則比方淋浴，其洗刷效果更為*，且也簡潔、迅速。已有試驗標(biāo)明，流水沖刷式一樣也適用于微量滴定板的洗刷。洗刷時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔外表，洗刷效果更佳（此辦法試劑盒較少選用）。
顯色和比色
顯色
顯色是ELISA中的終究一步溫育反響，此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強(qiáng)。恰當(dāng)進(jìn)步溫度有助于加快顯色進(jìn)行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時刻通常不需求嚴(yán)厲操控，有時可依據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯**況恰當(dāng)縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD底物顯色通常在室外溫或37℃反響20-30min后即不再加深，再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反響結(jié)束時參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙轉(zhuǎn)向棕。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反響調(diào)查成果。但為確保試驗成果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)則的恰當(dāng)時刻閱覽成果。TMB經(jīng)HRP效果后，約40min顯色達(dá)高峰，隨即逐步減弱，至2小時后即可*衰退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基*（SDS）等酶按捺劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍(lán)色保持較長時刻（12-24小時）不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，各類酸性停止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成，此刻可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，但應(yīng)盡量防止刮花外表，然后將板準(zhǔn)確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于規(guī)范96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這么，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反響僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液替代標(biāo)本作全進(jìn)程的孔），以記載本次試驗的試劑情況。這以后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行核算。
比色成果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)則用吸光度（absorbence，A），兩者含義一樣。通常的表明辦法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表明辦法為"A492nm"或"OD492nm"。
酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指于測讀ELISA成果吸光度的光度計。針對固相載體方式的不一樣，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。很多試劑公司配套供給酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的首要功能目標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測規(guī)模、線性等等。的酶標(biāo)儀的讀數(shù)通?？蓽?zhǔn)確到0.0 01，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083± 0.01(1.073~1.093），重復(fù)測定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測規(guī)模視各酶標(biāo)儀的功能而不一樣。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000，新類型的酶標(biāo)儀上限拓展達(dá)2.900，乃至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表明。應(yīng)留意可測規(guī)模與線性規(guī)模的不一樣，線性規(guī)模常小于可測規(guī)模，比方某一酶標(biāo)儀的可測規(guī)模為0.000~2.900，而其線性規(guī)模僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制造規(guī)范曲線時應(yīng)予留意。
ELISA試劑盒酶標(biāo)儀不該安頓在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，運(yùn)用前先預(yù)熱儀器15-30min，測讀成果更穩(wěn)定（也有一些酶標(biāo)儀闡明書上明晰標(biāo)明不需求預(yù)熱）。
測讀A值時，要選用產(chǎn)品的靈敏吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，在zui適波長（W1），第2次在不靈敏波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的方位。例如OPD用492nm為W1，630nm為W 2，終究測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可削減由容器上的劃痕或指印等形成的光攪擾。
各種酶標(biāo)儀功能有所不一樣，運(yùn)用中應(yīng)詳細(xì)閱覽闡明書。
成果判別
定性測定